Following Mitochondrial Footprints through a Long Mucosal Path to Lung Cancer

BACKGROUND:Mitochondrial DNA (mtDNA) mutations are reported in different tumors. However, there is no information on the temporal development of the mtDNA mutations/content alteration and their extent in normal and abnormal mucosa continuously exposed to tobacco smoke in lung cancer patients. METHODOLOGY:We examined the pattern of mtDNA alteration (mtDNA mutation and content index) in 25 airway mucosal biopsies, corresponding tumors and normal lymph nodes obtained from three patients with primary lung cancers. In addition, we examined the pattern of mtDNA mutation in corresponding tumors and normal lymph nodes obtained from eight other patients with primary lung cancers. The entire 16.5 kb mitochondrial genome was sequenced on Affymetrix Mitochip v2.0 sequencing platform in every sample. To examine mtDNA content index, we performed real-time PCR analysis. PRINCIPAL FINDINGS:The airway mucosal biopsies obtained from three lung cancer patients were histopathologically negative but exhibited multiple clonal mtDNA mutations detectable in the corresponding tumors. One of the patients was operated twice for the removal of tumor from the right upper and left lower lobe respectively within a span of two years. Both of these tumors exhibited twenty identical mtDNA mutations. MtDNA content increased significantly (P<0.001) in the lung cancer and all the histologically negative mucosal biopsies except one compared to the control lymph node. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE:Our results document the extent of massive clonal patches that develop in lifetime smokers and ultimately give rise to clinically significant cancers. These observations shed light on the extent of disease in the airway of smokers traceable through mtDNA mutation. MtDNA mutation could be a reliable tool for molecular assessment of respiratory epithelium exposed to continuous smoke as well as disease detection and monitoring. Functional analysis of the pathogenic mtDNA mutations may be useful to understand their role in lung tumorigenesis

РАЗРАБОТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРЕХМЕРНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ДЛЯ ИНДИВИДУАЛИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Background. To solve the problems of personalized medicine in oncology, preclinical studies based on the use of three-dimensional cellular models of tumors in vitro, including spheroids / tumoroids, are of great importance. They are an interesting tool for genetic, epigenetic, biomedical and pharmacological studies aiming to determine the most effective individual therapeutic approaches, since they allow modeling the dynamic evolution of a tumor disease from early stages to metastatic spread through interaction with the microenvironment.The purpose of the study was to compare characteristic features of formation and spatial organization of spheroids, obtained from solid malignant tumors cells with various histogenesis: melanomas, soft tissue sarcomas and osteosarcomas, epithelial tumors.Material and Methods. Solid tumor cell lines of patients who were treated from 2015 to 2021 were the basis for the creation of 3D-cell models. Fragments of tumor tissue were obtained intraoperatively: 15 samples of melanoma, 20 samples of soft tissue sarcomas and osteosarcomas, and 9 samples of epithelial tumors. All tumor cells were cultured for at least 10 passages. Methods of phase contrast, confocal microscopy, and histological techniques were used to study spheroids. Using ELISA methods and multiplex analysis, the supernatants of monolayer cell cultures and spheroids were studied for the presence of a wide range of biologically active substances that provide the processes of immunosuppression, invasion and metastasis.Results. The use of low adhesion surfaces was proven to be preferable to obtain spheroids of a given seed concentration and size of interest. The average cultivation time of spheroids was 4.7 days, and the optimal seeding concentration was 10,000 cells per well, while the spheroid diameter varied from 300 to 1000 μm depending on the type of malignant cells: the largest spheroids formed melanoma cultures. In general, the efficiency of spheroid formation was 88.6 % (39 out of 44). The introduction of fibroblasts into the 3D construct led to increasing in the invasive potential of tumor cells, which was associated with the production of IL8 (rho=0.636, p=0.035), HGF (rho=0.850, p=0.004), SCF (rho=0.857, p=0.014), FST (rho=0.685, p=0.029), Prolactin (rho=0.810, p=0.015), PECAM1 (rho=0.788, p=0.004).Conclusion. The technology of low-adhesive surfaces makes it possible to successfully create three-dimensional models of a tumor node from malignant tumors cells of various histogenesis. The colonization of a three-dimensional structure with fibroblasts enhances the biologically aggressive properties of tumor cells and demonstrates complex reciprocal interactions between the cellular elements of the tumor stroma and malignant cells, which brings the model closer to a real clinical situation. Введение. Для решения задач персонализированной медицины в онкологии важным становится этап предклинических исследований, основанный на использовании трехмерных клеточных моделей опухолей in vitro, в том числе сфероидов/тумороидов, которые представляют собой интересный инструмент для генетических, эпигенетических, биомедицинских и фармакологических исследований с целью определения наиболее эффективного индивидуального терапевтического подхода, так как позволяют моделировать динамическую эволюцию опухолевого заболевания от ранних стадий до метастатического распространения через взаимодействие с микроокружением.Цель исследования – провести сравнительные исследования особенностей формирования и пространственной организации сфероидов, полученных из клеток солидных злокачественных новообразований различного гистогенеза: меланом (МК), сарком мягких тканей и остеогенных сарком (СМТ/ОС), эпителиальных опухолей (ЭОп).Материал и методы. Основой для создания 3D-клеточных моделей служили культуры клеток солидных опухолей пациентов, которые проходили лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» в 2015–21 гг. Фрагменты опухолевой ткани были получены интраоперационно: 15 образцов МК, 20 – СМТ/ОС и 9 – ЭОп. Все опухолевые клетки культивировали не менее 10 пассажей. Для изучения сфероидов были использованы методы фазовой контрастной, конфокальной микроскопии, гистологическая техника. С помощью методов ИФА и мультиплексного анализа были изучены супернатанты монослойных клеточных культур и сфероидов на предмет присутствия широкого спектра биологически активных веществ, обеспечивающих процессы иммуносупрессии, инвазии и метастазирования.Результаты. Использование низкоадгезивных поверхностей оказалось предпочтительным для получения сфероидов заданной посевной концентрации и интересующего размера. Среднее время культивирования сфероидов составило 4,7 сут, оптимальная посевная концентрация – 10 000 клеток на лунку, при этом диаметр сфероида варьировал от 300 до 1 000 мкм в зависимости от типа злокачественных клеток: самые крупные сфероиды формировали культуры МК. В целом эффективность образования сфероидов составила 88,6 % (39 из 44). Введение в 3D-конструкцию фибробластов приводило к усилению инвазивного потенциала опухолевых клеток, который был ассоциирован с продукцией IL8 (rho=0,636, p=0,035), HGF (rho=0,850, p=0,004), SCF (rho=0,857, p=0,014), FST (rho=0,685, p=0,029), Prolactin (rho=0,810, p=0,015), PECAM1 (rho=0,788, p=0,004). Заключение. Технология низкоадгезивных поверхностей позволяет успешно создавать трехмерные модели опухолевого узла из клеток злокачественных новообразований различного гистогенеза. Заселение трехмерной конструкции фибробластами усиливает биологически агрессивные свойства опухолевых клеток и демонстрирует сложные реципрокные взаимодействия между клеточными элементами стромы опухоли и малигнизированными клетками, что приближает модель к реальной клинической ситуации.

Разработка лабораторных моделей in vitro иммунного микроокружения опухоли для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины

Purpose of the study: development of in vitro laboratory models to evaluate quality parameters and specific efficacy of dendritic cell vaccine (DCV).Material and Methods. Biological samples of malignant tumor patients treated with autologous dendritic cell vaccine (DC) were included into the study. Immature DCs (n=46) and mature DCs (n=56) were used to induce proliferation of antigen-specific T lymphocytes (n=227). Autologous tumor cells from skin melanoma (n=10) or sarcoma (n=8) patients in the xCELLigence® assay system were used to study the in vitro antitumor cytotoxic activity of generated CTLs (n=18). The secretion of cytokines and cytolytic proteins was studied by multiplex analysis. The subpopulation composition of effector T-lymphocytes was determined by flow cytometry.Results. We revealed that mature DCs (CD83+CD1a-) had a high expression of antigen presenting molecules (HLA-DR) and those providing migration of DCs into lymph nodes (CCR7) as well as costimulatory molecules CD80 and CD86 as compared to immature DCs (CD83-CD1a+). Induction of mature DCs was found to stimulate an increase in the relative content of proliferating T cells compared with stimulation of immature DCs (p&lt;0.001) and specific PTA+ tumor lysate (p&lt;0.001). When studying cytotoxic activity of effector T-lymphocytes, we developed 2D in vitro models using xCELLigence® analytical system and revealed 2 types of interaction: 1) in vitro model № 1 – decrease in cell index (CI) of autologous tumor cell culture in the presence of activated effector T lymphocytes; 2) in vitro model № 2 – no change in CI of autologous tumor cell culture when co-cultured with activated effector T cells compared to control (72 h observation). The results demonstrated cytotoxic activity of antigen-specific T lymphocytes due to high content of terminally differentiated cytotoxic T lymphocytes (TEMRA), GrB-producing CTLs, and cytokine secretion profile.Conclusion. Requirements for the quality of personalized autologous DCs, including control of immunophenotypic characteristics were developed, and functional activity of Tlymphocytes during induction of mature vaccine DCs was evaluated. A laboratory procedure was developed for quantitative assessment of cytotoxic activity of antigen-specific T-lymphocytes against autologous tumor using the xCELLigence® analytical system, thus allowing for personalized monitoring and predicting the effectiveness of DСV treatment.Цель исследования ‒ разработка in vitro лабораторных моделей для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины (ДКВ).Материал и методы. В исследование включены биологические образцы больных злокачественными новообразованиями, получавших вакцинотерапию на основе аутологичных дендритных клеток (ДК). Для индукции пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов (n=227) использовали незрелые ДК (n=46) и зрелые ДК (n=56). Для изучения противоопухолевой цитотоксической активности in vitro генерированных ЦТЛ (n=18) использовали аутологичные опухолевые клетки меланомы кожи (n=10) или сарком (n=8) пациентов в аналитической системе xCELLigence®. Секрецию цитокинов и цитолитических белков изучали методом мультиплексного анализа, субпопуляционный состав эффекторных Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии.Результаты. В работе показано, что зрелые ДК (CD83+CD1a-) отличаются высокой экспрессией молекул, презентирующих антиген (HLA-DR) и обеспечивающих миграцию ДК в лимфатические узлы (CCR7), а также костимулирующих молекул CD80 и CD86, по сравнению с незрелыми ДК (CD83-CD1a+). Установлено, что индукция зрелыми ДК стимулирует рост относительного содержания пролиферирующих Т-клеток по сравнению со стимуляцией незрелыми ДК (р&lt;0,001) и специфическим РТА+ опухолевым лизатом (р&lt;0,001). При изучении цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов разработана 2D in vitro модель с использованием аналитической системы xCELLigence® и выявлено 2 типа взаимодействия: 1) лабораторная модель № 1 – снижение клеточного индекса (CI) культуры клеток аутологичной опухоли в присутствии активированных эффекторных Т-лимфоцитов; 2) лабораторная модель № 2 – отсутствие изменений CI культуры клеток аутологичной опухоли при ее кокультивировании с активированными эффекторными Т-клетками по сравнению с контролем (72 ч наблюдения). Результаты демонстрируют цитотоксическую активность антиген-специфических Т-лимфоцитов, что обусловлено высоким содержанием терминальнодифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов (TEMRA), ЦТЛ, продуцирующих GrB, и профилем секреции цитокинов.Заключение. Разработаны требования к качеству персонализированной аутологичной ДКВ, включающие контроль иммунофенотипических характеристик, проведена оценка функциональной активности Т-лимфоцитов при индукции зрелыми вакцинными ДК. Разработан лабораторный регламент количественной оценки цитотоксической активности антиген-специфических Т-лимфоцитов в отношении аутологичной опухоли с использованием аналитической системы xCELLigence®, что позволит проводить персонализированный мониторинг и может прогнозировать эффективность проводимого лечения ДКВ

Deceleration of Fusion–Fission Cycles Improves Mitochondrial Quality Control during Aging

Mitochondrial dynamics and mitophagy play a key role in ensuring mitochondrial quality control. Impairment thereof was proposed to be causative to neurodegenerative diseases, diabetes, and cancer. Accumulation of mitochondrial dysfunction was further linked to aging. Here we applied a probabilistic modeling approach integrating our current knowledge on mitochondrial biology allowing us to simulate mitochondrial function and quality control during aging in silico. We demonstrate that cycles of fusion and fission and mitophagy indeed are essential for ensuring a high average quality of mitochondria, even under conditions in which random molecular damage is present. Prompted by earlier observations that mitochondrial fission itself can cause a partial drop in mitochondrial membrane potential, we tested the consequences of mitochondrial dynamics being harmful on its own. Next to directly impairing mitochondrial function, pre-existing molecular damage may be propagated and enhanced across the mitochondrial population by content mixing. In this situation, such an infection-like phenomenon impairs mitochondrial quality control progressively. However, when imposing an age-dependent deceleration of cycles of fusion and fission, we observe a delay in the loss of average quality of mitochondria. This provides a rational why fusion and fission rates are reduced during aging and why loss of a mitochondrial fission factor can extend life span in fungi. We propose the ‘mitochondrial infectious damage adaptation’ (MIDA) model according to which a deceleration of fusion–fission cycles reflects a systemic adaptation increasing life span

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ НА МОДЕЛИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ КОЖИ

The results of the experimental study of immune response of human skin malignant melanoma cells Mel 226 on photodynamic exposure are represented in the article. Photoinduced apoptosis of skin malignant melanoma was studied in vitro. The study showed that irradiation with the agent fotoditazin at dose of 0.5–2.5 µg/ml (6 and 10 min exposure 30 min before irradiation; irradiation parameters: wavelength of 662 nm, total light dose from 40 to 60 J/cm2) induced early apoptosis. The increase of the time of laser irradiation significantly accelerates the conversion of photosensitized tumor cells from early to late apoptosis.В статье представлены результаты экспериментального исследования иммунного ответа клеток меланомы кожи человека Mel 226 на фотодинамическое воздействие. Изучен фотоиндуцированный апоптоз клеток меланомы кожи in vitro. Исследования показали, что облучение с препаратом фотодитазин в концентрациях 0,5-2,5 мкг/мл (экспозиция в течение 6 и 10 мин за 30 мин до облучения; параметры облучения: длина волны 662 нм, суммарная доза облучения от 40 до 60 Дж/см2) индуцирует ранний апоптоз. Увеличение времени лазерного облучения достоверно ускоряет переход фотосенсибилизированных опухолевых клеток из ранней фазы апоп-тоза в позднюю

URGENT X-RAY DIAGNOSTICS OF INTRACRANIAL PYOINFLAMMATORY OTORHINOSINUSOGENIC COMPLICATIONS

An analysis of the results of X-ray CT and MR-imaging was made in 46 patients aged from 13 to 78 years old. The patients were admitted to multifield hospitals in Kursk at the period from 2005 to 2015. The research included the nasal cavity, paranasal sinuses, mastoid and pyramid of the temporal bones and the brain. The study could be repeated with bolus contrast medium infusion. The condition of the patients was evaluated in dynamics at intervals of 5-7 days and these data was associated with clinical picture. The authors presents a complex of symptoms and an algorithm of differentiated X-ray diagnostics of diseases of the ENT organs and the main nosological forms of pyoinflammatory diseases of arachnoid membrane and substances of the brain